上海起發(fā)大量現(xiàn)貨alstembio VB100說明書

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上海起發(fā)大量現(xiàn)貨alstembio VB100說明書

ViralBoost Reagent: #VB100

ViralBoost試劑：＃VB100

描述

ViralBoost試劑（500X）是一種新型的小分子混合物，可以增強(qiáng)病毒的產(chǎn)生，并且是有效包裝病毒的強(qiáng)大，廣泛適用的試劑。ViralBoost試劑在轉(zhuǎn)錄水平上穩(wěn)定地調(diào)節(jié)病毒RNA的包裝，可將逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒顆粒的產(chǎn)量提高多達(dá)10倍。易于使用的協(xié)議使ViralBoost試劑非常適合各種規(guī)模的病毒包裝。

圖1.來自GFP反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)，GFP反轉(zhuǎn)錄病毒在不存在ViralBoost試劑的情況下包裝。

圖2. GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞，有和沒有ViralBoost包裝

ViralBoost試劑是一種新型的小分子混合物，可用于高滴度病毒生產(chǎn)，并且是有效包裝病毒的強(qiáng)大，廣泛適用的試劑。它在轉(zhuǎn)錄水平上穩(wěn)定地調(diào)節(jié)病毒RNA的包裝，可以極大地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒顆粒的產(chǎn)量，多可提高10倍。易于使用的協(xié)議使ViralBoost試劑非常適合各種規(guī)模的病毒包裝。

使用流程：

一天：轉(zhuǎn)染前一天，

1.用1x明膠涂板/盤子30分鐘。吸出明膠，并每100 mm平板接種約3-4 X 10 ^6個(gè) HEK 293T細(xì)胞。每個(gè)板使用10 ml培養(yǎng)基。

注意：擁有良好的單細(xì)胞懸液（胰蛋白酶消化良好）并均勻分布細(xì)胞非常重要。

第二天：轉(zhuǎn)染

注意：按照制造商的規(guī)程準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

2.準(zhǔn)備兩個(gè)試管，然后向每個(gè)試管中加入0.5 ml DMEM。在一個(gè)試管中加入DNA混合物（包含病毒載體和包裝混合物），并通過輕敲試管將其充分混合。在另一個(gè)管中，添加NanoFect（目錄號(hào)NF100）。通過互聯(lián)管混合。

注意：在室溫（20–25°C）下孵育不超過5分鐘。

3.將NanoFect-DMEM混合物轉(zhuǎn)移到DNA管中，上下吸移2-3次。渦旋5-10秒，充分混合。

4.在室溫下孵育約15分鐘，以使NanoFect / DNA復(fù)合物自組裝。

5.滴加NanoFect / DNA混合物到板中，輕輕搖動(dòng)板并將板放回培養(yǎng)箱中

第三天：更換培養(yǎng)基并添加ViralBoost

6.用10 ml新鮮培養(yǎng)基代替上清液，并補(bǔ)充20 µl ViralBoost（500X）。將板返回細(xì)胞培養(yǎng)箱。

第四天：收集病毒

！注意小心處理病毒材料，避免溢出。使用漂白劑對(duì)危險(xiǎn)液體進(jìn)行消毒（終濃度為10％，持續(xù)30分鐘）。

7.將上清液收集在50 ml錐形管中，并置于冰上。離心機(jī)中以千克上清液10分鐘，以除去細(xì)胞碎片。（將離心機(jī)預(yù)設(shè)為4°C）

8.通過0.45 µm過濾器過濾上清液。將已過濾的上清液轉(zhuǎn)移至無菌容器中，并每隔4體積的含病毒上清液添加1體積的冷逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒沉淀溶液（4°C，目錄號(hào)VC100和VC200）。（例如：5毫升逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒沉淀溶液和20毫升病毒上清液）。

9.充分混合并冷藏過夜。

第五天：濃縮病毒

10.將混合物在4°C下以1500g離心30分鐘。離心后，病毒顆粒可能在容器底部呈米色或白色沉淀。

11.丟棄上清液。通過以1500g離心5分鐘來旋轉(zhuǎn)殘留溶液。抽吸去除所有液體，注意不要擾亂沉淀中沉淀的病毒顆粒。

12.使用冷的無菌PBS或DMEM在4°C下以原始體積的1/10至1/100重懸病毒沉淀。分裝在低溫小瓶中，并在-80°C下儲(chǔ)存直至準(zhǔn)備使用。

注意：可以使用病毒濃縮/純化程序除去ViralBoost試劑。當(dāng)直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK 293T細(xì)胞時(shí)，尚未檢測(cè)到帶有ViralBoost試劑的病毒顆粒粗品對(duì)目的基因表達(dá)的副作用，但不同細(xì)胞系之間可能存在差異。建議事先測(cè)試ViralBoost對(duì)靶細(xì)胞的作用。