長讀長測序技術痛點：DNA提取速度、產量是關鍵

本文轉自測序中國 作者：戴勝 

近年來，Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies、Bionano Genomics和10x Genomics等公司的長讀長測序和基因組圖譜技術越來越受歡迎。隨著相關技術的推廣應用，長讀長測序技術在快速、高效提取高質量高分子量DNA方面的痛點日益凸顯。

長讀長測序技術痛點：DNA提取速度、產量是關鍵

在過去的基因組研究中，人們可能會更多的選擇短讀長測序。現在，那些新開展的基因測序研究更愿意選擇PacBio、Oxford Nanopore、Biona0x Genomics等公司的技術。例如將為地球上所有66,000種脊椎動物物種生成參考基因組的脊椎動物基因組計劃(VGP)，就已承諾在研究中使用高通量基因組圖譜技術和長讀長測序技術。

利用目前已有的許多DNA提取標準方法，如色譜柱法和磁珠法，獲得高分子量DNA并不容易。大多數用戶終選擇的還是非常傳統的方法，如瓊脂糖包埋純化，通過將DNA嵌入瓊脂糖凝膠中以保護其免受溶液體系剪切力的影響；或者進行苯酚氯方萃取沉淀。這些方法可以提供純化的長DNA片段，但缺點是速度慢，難以實現規模化生產。

洛克菲勒大學脊椎動物基因組學實驗室將為VGP項目提供測序數據，該實驗室主任Olivier Fedrigo表示，BioNano的圖譜平臺需要200Kb及以上的DNA片段，其他技術如PacBio和10x Genomics則可以獲取更短的DNA片段，但實驗室決定采取一種適用于所有情況的DNA提取方法。DNA片段不僅要非常長，還要非常純，不存在蛋白質或其他污染物，這對納米孔測序尤為重要。

目前，該研究團隊已經決定使用Bionano的一種瓊脂糖凝膠提取試劑盒及方案，該方案可提取超過250Kb的DNA片段，適用于本所有的下游應用，并適用于不同樣本類型，包括動物組織、血液、細胞系和植物。但問題在于，該方案流程為7~10天，并且很難實現自動化，產量不足以進行PacBio測序，一旦開始用于VGP的高通量基因組組裝就會出現問題。因此研究團隊必須調整Bionano的試劑盒，提高DNA產量。

從個體基因組中獲取長片段DNA，是進行基因組測序的關鍵。Bionano和Nanopore等公司獲取真正長DNA片段信息主要依賴于DNA的高分子量提取。為了從人的細胞中提取納米孔測序用的長片段DNA樣本，英國伯明翰大學Josh Quick研究員與同事使用了傳統的苯酚-氯方制備技術，該技術已經沿用了數十年，可使DNA保持較高的濃度，并在一定程度保持DNA片段的長度。但遺憾的是，這種方法同樣難以自動化。人們往往喜歡談論獲得的長read，但那只是為了吸引客戶，真正需要關心的N50。重要的是，獲得的長片段DNA有多少是可用的？

多家公司已經接受了這項挑戰，如Circulomics、Bionano、Sage Science和RevoluGen，其共同目的是開發一種高通量方法，可從不同的樣品類型中提取數百Kb和長達Mb的DNA分子。此外，一些學術團體也一直在開發自用的提取方法，以滿足研究中的特定需求。下面，我們一起看看這些公司的研究進展。

Bionano Genomics

Bionano 公司一直在開發提取高質量超高分子量DNA的方法。使用的是經過多年研制的瓊脂糖凝膠化學試劑，并提供了有關DNA長度的標準。公司內部和第三方合作伙伴都在努力開發更快、更自動化的樣本制備方法，并計劃在未來的幾個月內發布新產品。

改進樣品制備方法，首先要以保持DNA完整性的方式收集和儲存樣本。如果開始使用的樣本就很差勁，也就無法提取高質量的DNA。目前，Bionano已經可提供用于冷凍和處理的哺乳動物血液樣本的方案，并正在研究其他各種組織樣本的處理方案。

在DNA提取方面，Bionano正在投資不使用瓊脂糖凝膠的替代樣本制備方案和試劑盒，其速度更快且是自動化的。據悉，該試劑盒可提取高純度的DNA，平均片段長度為250Kb以上。同時，該公司正在研究新的解決方案和雜質去除方法。目的是即在相同工作流程時間內（幾小時內），達到NGS測序的DNA提取標準。許多用戶會對快速且不需要貴重設備的提取試劑盒感到滿意，自動化將有助于其擴展到一次進行更多樣本的檢測應用。

Circulomics

Circulomics公司一直與Bionano合作開發新的DNA提取技術。該公司開發了一種Nanobind技術，其原理類似于常規的磁珠提取DNA ，但該技術不會使用數百萬的小顆粒，而是利用具有納米結構二氧化硅表面的小磁盤與DNA結合，其表面會保護DNA不被剪切。在不同的儀器類型中使用，Nanobind可在半小時內處理12到96個樣本，可在1小時左右獲得數百Kb的DNA片段。Nanobind有一個自動化版本，可在賽默飛世爾科技的KingFisher平臺運行。

通常情況下，DNA分子必須被剪切到合適的尺寸才能更好的進行測序檢測。Circulomics采用兩種策略，一種是使DNA長達數百Kb，滿足長讀長測序要求；另一種是為Bionano等應用產生超高分子量的DNA，以適用于任何提取試劑盒。此外，Circulomics還在開發DNA文庫制備純化方法，同樣使用納米磁盤作為提取工具，但使用不同的化學物質去除短DNA片段、鹽或蛋白質。

目前，Circulomics公司銷售兩種Nanobind DNA提取試劑盒：一種用于細胞、細菌或血液，另一種用于植物細胞核。此外，該公司正在利用研發中的試劑為不常見樣本提供定制化DNA提取服務。同時，Circulomics還在開發一種用于組織DNA提取的商業試劑盒，可適用于多種生物和組織樣本。這將涉及一些特殊的同質化步驟和雜質去除方法，尚難以實現自動化。

Sage Science

2017年，Sage Science公司推出了一種用于提取高分子量DNA的儀器，名為Sage HLS。該系統采用電泳技術，每次多可處理四個樣本，包括細胞、細胞核或球形細胞的懸浮液。整個制備過程需要2~6小時，DNA可保持數Mb大小，并纏繞在樣本的瓊脂糖壁中。在加入非特異性酶或CRISPR/Cas9復合物后，DNA被切割，并分離純化。

Sage Science方面表示，Sage HLS的一個主要優點就是，DNA分子不會暴露在粘滯剪切下，因此可以分離出非常高分子量的DNA，大小可達2Mb。此外，研究人員已經在利用Cas介導的系統分離50~400Kb之間的DNA片段，并正努力將范圍增大到1Mb。

RevoluGen

英國的RevoluGen是另一家致力于開發高分子量DNA提取新方法的公司。該公司開發了一種名為Fire Monkey的自旋柱試劑盒，其使用的專有技術可確保DNA保持完整，工作流程約為1小時。

RevoluGen方面表示，依賴*的溶液和基質化學成分，在任何環節都不會像其他自旋柱試劑盒那樣破壞DNA。Fire Monkey獲得的DNA尺寸高達500 Kb，如果是新鮮樣本，平均片段大小可大于100 Kb。此外，與其他方法提取的DNA相比，該方法獲得的DNA具有較少的缺口，可減少對長讀長測序的干擾。

Fire Monkey可以被復用，處理樣本數量幾乎不受限制。此外，該方法也可通過磁珠技術實現自動化，目前該公司尚未進行相關工作。實現自動化的一個挑戰就是，DNA往往長、短片段混合在一起。為了解決這一問題，RevoluGen開發了一種名為Fire Flow的DNA大小分離技術，可在文庫制備過程中去除10Kb及以下的DNA片段。

參考資料：

DNA Extraction Remains Bottleneck for Long-Read Techs But Solutions Begin to Emerge