常見免疫組化難題集錦（上）

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1、石蠟切片和冰凍切片的比較？
（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
（2）冰凍切片的優點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。
（3）石蠟切片的優點可以保持組織細胞的形態結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態都較冰凍切片好。

2、一抗的選擇要點和技巧是什么？
（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。
（2）應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。
（3）種屬反應性的選擇（species reactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。
（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。

3、在什么情況下使用TritonX-100？
（1）Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學（>10um厚切片） 和免疫細胞化學中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。
（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。
（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用，具體參閱： http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=12301317&sty=1

4、封閉血清的選擇原則是什么？
（1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽性！
（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合，會造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。
5、抗體孵育條件的比較？
（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。
（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。

6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復溫？
一種說法是防止切片從4度直接放入PBS易脫片；另外一種觀點是使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發生過脫片現象。

7、DAB顯色時間如何把握？
（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；
（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；
（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；
（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。

8、免疫組化結果如何分析？
（1）陽性著色細胞計數法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。
（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統計分析即可。
（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），zui終可以分數相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。

9、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？
（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。
（2）修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。
（3）微波修復，我們一般用6min*4次，效果不錯。

10、內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？
（1）一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右；而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10~30min。
（2）用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片.
（3）現用現配，配好后4度避光保存。