熒光二抗的選擇——Dylight熒光與傳統熒光標記的比較

顧名思義，熒光二抗通常指代的就是帶熒光團標記的二抗，這樣的二抗可以通過觀察其在不同波長下熒光的強度來確定其二抗的含量。常見的熒光團包括FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Cy系列等。比如FITC即異硫氰酸熒光素，是目前應用zui廣泛的熒光素。zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發射光波長為 520～530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。其優勢是分子量較小為389.4，每一個抗體可標記幾個FITC分子，而且人眼對黃綠色較為敏感，因此具有很好的對比度其缺點是淬滅快。羅丹明（Rhodamin）及其衍生物則是一群帶黃紅色熒光的熒光素，包括TRITC、Texas Red等。羅丹明及其衍生物與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色，但是其熒光強度偏弱，其中Rhodamin比Texas Red熒光又要偏弱。艾美捷能為客戶提供全系列的各種*熒光二抗，包括Jackson的大包裝粉末形式的熒光二抗，另外，也提供EarthOx的小包裝液體形式熒光二抗，均具有很高的性價比。更多二抗產品，請查看：艾美捷二抗產品。

花箐素Cy是另一類熒光團，包括綠色的Cy2、黃紅色的Cy3、紅色的Cy5、近紅外的Cy5.5等熒光染料，由于結構的稍微區別，其吸收和發射波長也有所區別。比如Cy2耦聯基團激發波長為492nm，發光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片，但是要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩定，背景更弱。Cy3耦聯基團激發光的zui大波長為550nm，zui強發射光為570nm。因為激發光和發射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的zui大發射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發。通常觀察Cy5時采用具有合適激發光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡。下面我們看一組熒光二抗的比照圖片：

我們知道，FITC的綠色熒光強度肉眼觀察已經很亮了，但是從左上面的圖可見，與Cy2相比還是偏弱，而Dylight 488則更勝*；右上圖是不同熒光團在含有90%甘油的PBS里的熒光淬滅情況，由圖可見。FITC的淬滅都很快，Cy2其次，而Dylight 488和Alexa 488都具有很好的光穩定性。下面再看另一組有關于紅色熒光的數據：

由左上圖可見，Dylight 594比Alexa 594和Texas Red的熒光強度都要強，Dylight 594的特異性也很好；同樣，右上圖顯示Dylight 594的光穩定性也很優異。那么Dylight到底是一種什么樣的熒光團？不管在結構以及功能和應用上，Dylight都是一種新的熒光團，與傳統的熒光團相比，其分子量相對較小，因此一個大分子上可以標記更多的Dylight，同時單個的Dylight熒光團，其熒光強度更強，特異性更好；Dylight對光更穩定，這意味著其具有更高的抗淬滅性，不像FITC因為快速發生淬滅而無法及時捕捉到熒光圖像。Dylight還有一個優勢是種類很全，比如做三標的時候，除了常見的紅色和綠色熒光，藍色熒光應該是第三選擇，Dylight 405就是藍色的。Dylight 488是綠色的，可*替代FITC；*替代Cy3和Rhodamin的Dylight 549；替代Texas Red的Dylight 594；Dylight 633和Dylight 649則是更強的紅色熒光；另外，Dylight還有適配Odyssey系統的近紅外和遠紅外二抗，分別是Dylight 680和Dylight 800。

可能還需要考慮的一個問題是價格的問題，其實Dylight的熒光二抗與常規熒光二抗相比，具有更高的性價比，一般來說，Dylight的價格比常規二抗只高20%左右，但是Dylight的效價通常是常規熒光二抗的2-4倍左右，因此就zui終的性價比，Dylight更勝*。舉例來說，EarthOx的FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗（貨號為E031210），100μl是￥160；而相應的EarthOx的Dylight 488標記的山羊抗小鼠IgG二抗（貨號為E032210），100μl報價是￥240，但是在具體使用時，比如免疫熒光實驗，其推薦稀釋比率分別為1:100和1:400，即100μl的FITC標記山羊抗小鼠IgG二抗（貨號為E031210）zui終使用液是10ml，而100μl的Dylight 488標記山羊抗小鼠IgG二抗（貨號為E032210）zui終使用液是40ml，可見，即使不考慮Dylight更高的熒光強度、更好的光學穩定性和特異性，但就價格來說，Dylight熒光二抗也具有更高的性價比。

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