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肽核酸（PNA）端粒探針熒光原位雜交（FISH）實驗方案

原理上，熒光原位雜交（FISH）技術(shù)應(yīng)能提供單個染色體的端粒長度信息。直接標記的寡核苷酸探針因其尺寸小（穿透性好）、單鏈性質(zhì)（無需探針變性）及可控制合成等特點，成為此類分析中有吸引力的探針。

然而，針對端粒重復序列的寡核苷酸雜交效率有限，該方法僅能用于不同物種染色體中TTAGGG重復序列的定性研究。近期研究表明，肽核酸（PNA）寡核苷酸探針可與互補寡核苷酸序列雜交，且形成的雙鏈穩(wěn)定性高于DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈。

在PNA中，傳統(tǒng)DNA和RNA寡核苷酸的帶電磷酸-（脫氧）核糖骨架被由重復的N-（2-氨基乙基）-甘氨酸單元通過肽鍵連接而成的不帶電骨架所取代。與DNA寡核苷酸相比，PNA寡聚體具有更高的序列特異性、更好的穩(wěn)定性、可重復性以及更低的背景信號。由于PNA/DNA雙鏈的解鏈溫度（Tm）更高，短鏈（18聚體）端粒PNA探針（CCCTAA）?被廣泛應(yīng)用。

實驗前準備

一、端粒PNA探針制備

1.  打開試管前先離心，使凍干的PNA探針聚集在試管底部。

2.  向試管中加入甲酰胺，配制PNA探針儲備液。

3.  用PNA雜交緩沖液稀釋儲備液，使終濃度達到200nM。

? 注意：探針溶液需避光，4℃儲存。

二、溶液制備

1.  雜交緩沖液

20mM 磷酸氫二鈉（Na?HPO?），pH 7.4

20mM 三羥甲基氨基甲烷（Tris），pH 7.4

60% 甲酰胺

2×標準檸檬酸鹽溶液（SSC）

0.1μg/ml 鮭魚精DNA

2.  核糖核酸酶A（RNase A）溶液

在2×SSC中加入RNase A，終濃度為100μg/ml

3.  0.005%胃蛋白酶溶液

取50μl 5%胃蛋白酶儲備液，加入50ml 0.01M鹽酸（HCl）中稀釋。

? 注意：現(xiàn)配現(xiàn)用！使用前預(yù)熱至45℃。

4.  洗滌液

2×SSC/0.1%吐溫-20（Tween-20）

雜交與洗滌步驟

一、預(yù)處理

1.  按照特定細胞系的推薦流程制備玻片，自然晾干。

2.  將玻片浸入磷酸鹽緩沖液（PBS）中，孵育15分鐘。

3.  用含4%多聚甲醛的PBS溶液在37℃下固定玻片4分鐘。

4.  加入500μl RNase A溶液，37℃孵育1小時。

5.  向潔凈培養(yǎng)皿中加入500μl RNase A溶液，將每張玻片的樣本面朝下置于溶液上，37℃孵育1小時。

? 注意：避免玻片干燥。

6.  用2×SSC洗滌（重復3次），再用去離子水（DW）洗滌。

7.  將玻片浸入0.005%胃蛋白酶溶液中，37℃孵育4分鐘。

8.  用PBS在37℃下洗滌3分鐘（重復2次）。

9.  重復步驟3-4。

10. 在室溫下用PBS洗滌5分鐘。

11. 用梯度冷乙醇脫水（70%、85%、100%乙醇各浸泡1分鐘）。

12. 自然晾干玻片。

二、雜交

1.  將玻片放入預(yù)熱至80℃的培養(yǎng)箱中，孵育5分鐘。

2.  向每張玻片的標記區(qū)域加入20μl含PNA探針的雜交緩沖液。

? 注意：雜交緩沖液使用前需在90℃加熱5分鐘。

3.  用18×18mm蓋玻片覆蓋玻片的標記區(qū)域。

? 注意：避免玻片干燥。

4.  將玻片在85℃下變性10分鐘。

? 注意：變性溫度需控制在80℃-90℃之間。

仔細檢查培養(yǎng)箱溫度。

變性溫度低于75℃會嚴重影響實驗結(jié)果。

5.  將玻片置于避光環(huán)境中，室溫孵育1小時。

三、洗滌

1.  將玻片浸入室溫下的洗滌液中，移除蓋玻片。

2.  在55-60℃下用洗滌液洗滌玻片10分鐘（重復2次）。

? 注意：洗滌溫度需嚴格控制在55-60℃。

3.  在室溫下用洗滌液洗滌玻片1分鐘。

四、復染

1.  將玻片浸入DAPI/2×SSC溶液中，染色10分鐘。

2.  用2×SSC洗滌玻片2分鐘。

3.  用1×SSC洗滌玻片2分鐘。

4.  用去離子水（DW）洗滌玻片2分鐘。

5.  離心干燥玻片。

6.  在玻片的目標區(qū)域滴加一滴封片液。

7.  蓋上蓋玻片，使封片液在蓋玻片下均勻擴散，避免產(chǎn)生氣泡。

8.  使用配備相應(yīng)濾光片的熒光顯微鏡觀察染色后的玻片。

參考文獻

1. Kentaro Taemura 等，2005年，《發(fā)育生物學》（Developmental Biology），第281卷，196-207頁。

2. Won-Wo Woo Lee 等，2002年，《免疫學》（Immunology），第105卷，458-465頁。

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5. M. Hultdin 等，1998年，《核酸研究》（Nucleic Acids Research），第26卷（16期），3651-3656頁。

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