PHAGOTEST試劑盒使用說明

1. 試劑盒簡介
PHAGOTEST試劑盒，用于定量檢測全血中白細胞吞噬功能。試劑盒中包括FITC熒光標記的調理大腸桿菌，細胞發(fā)生吞噬作用對FITC標記的大腸桿菌進行攝取。采用流式細胞儀測定具有吞噬功能的細胞（粒細胞和單核細胞）總百分以及細胞的吞噬活性（每個細胞吞噬的細菌數目）。
試劑盒可以考察藥物是否引起機體細胞吞噬作用改變。異常的吞噬作用通常會發(fā)生在多種臨床疾病，例如，中性粒細胞自身缺陷，免疫球蛋白及補體缺陷等。先天性缺陷，例如白細胞整合素缺陷，肌動蛋白功能障礙等，均會到導致感染的風險增加以至于引起中性粒細胞吞噬功能的缺陷。獲得性缺陷相關的吞噬作用的改變通常發(fā)生在外科創(chuàng)傷，糖尿病，腎衰竭，全身性感染和急性胰腺炎等。吞噬功能的降低還會發(fā)生在燒傷感染的病人，AIDS病人，老年人，新生兒，采用糖皮質激素或者麻醉藥治療的病人等。
在一些體外或者體內試驗中，可以觀察到多種免疫調節(jié)劑，例如白介素-2，干擾素-γ，植物提取素等可以增強中性粒細胞和單核細胞的吞噬功能。
試劑盒不僅適用于人的血樣，同樣也適用于大小鼠，兔，狗，牛及其他種屬。
2. 材料和試劑
2.1 試劑盒包括以下試劑
? REAG A（ 試劑A）
1x洗液：將1整瓶REAG A粉末溶解在1L的雙蒸水中。
? REAG B（試劑B）
1瓶（2mL），1x濃度的穩(wěn)定且用FITC標記的調理大腸桿菌（E.coli），大約2x109個菌/mL。
? REAG C（試劑C）
1瓶（10 mL），1x濃度的淬滅溶液，用于淬滅在細胞外的細菌熒光表達，藍色溶液。
? REAG D（試劑D）
1瓶（20 mL）的裂解液（10x儲備液濃度）。在使用前用雙蒸水按1:10進行稀釋，配制成1x的裂解液，用于裂解紅細胞和固定白細胞。
? REAG E（試劑E）
1瓶（20 mL），1x濃度的DNA染液（粉色溶液），用于流式細胞儀分析時區(qū)別細菌和白細胞。

儲存條件和穩(wěn)定性：試劑盒需要在2-8℃避光條件。使用前將大腸桿菌（REAG B）充分渦旋混勻或者用針抽吸使其分散。試劑內含有防腐劑，但是不會吞噬功能的檢測。試劑的有效期同試劑盒包裝上標明一致。
2.2 試劑盒未包括以下材料，但需要準備
? 血液采集用的肝素化抗凝管。
? 12x75 mm的一次性試管（BD公司的Falcon管，貨號：352052）和合適數量的試管架。
? 500 mL和1000 mL的試劑瓶，用于保存1x洗液和1x裂解液。
? 帶蓋的冰浴盒。
? 雙蒸水或者注射用水，用于配制1x洗液和1x裂解液。
? 合適量程的移液器（20-200 μL, 100-1000 μL），一次性槍頭。
? 連續(xù)加樣器和槍頭。
? 水浴鍋。
? 數字式溫度計。
? 渦旋器
? 冷凍離心機（配有12x75 mm的吊杯）。
? 488 nm激發(fā)波長（氬離子激光）的流式細胞儀。
3. 操作過程
2.1 準備
? 配制1x洗液。
? 根據測試的樣本量配制1x裂解液（試劑D）， 2mL/測試樣。
? 準備冰浴。
? 預熱水浴鍋至37℃，溫度必須控制！
? 開啟流式細胞儀，用校準微球（beads）進行校準。
3.2 樣本處理
3.2.1 加樣
將肝素化抗凝的全血渦旋混勻后，在5 mL試管（Falcon管）底部各加100 μL全血。一般取2支試管，其中1支為陰性對照管，另1支為測試管。將所有試管放入冰浴中10 min，使血樣降低溫度至0℃。
注意：勿將血液殘留在試管壁上。不要使用EDTA或者檸檬酸抗凝管采集全血。
3.2.2 激活
渦旋混勻已經預冷的大腸桿菌（REAG B），每支試管（即陰性對照管和測試管）中均加入20 μL的REAG B。
3.2.3 孵育
所有試管再次混勻后，陰性對照管置于冰上；測試管則置于37°C水浴中，孵育10 min。孵育時間和溫度必須嚴格監(jiān)控，水浴箱必須蓋住
3.2.4 淬滅
孵育結束后，將同一試管架上所有樣本同時拿出水浴箱，放置于冰上阻止吞噬過程，在所有試管加入100 μL冰冷的淬滅溶液（REAG C），冰上操作，渦旋混勻。
3.2.5 洗滌
每支試管加入3 mL 1x洗液（REAG A），渦旋混勻，離心細胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
再洗一次。每支試管加入3 mL 1x洗液（REAG A），渦旋混勻，離心細胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
3.2.6 裂解和固定
每支試管加入2 mL預熱至室溫的1x 裂解液（REAG D），渦旋混勻，室溫避光孵育20 min。離心（5 min，250xg，2-8°C），去除上清液。
3.2.7 洗滌
每支試管加入3 mL 1x洗液（REAG A），渦旋混勻，離心細胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
3.2.8 DNA染色
每支試管加入200 μL DNA染液（REAG E），混勻，避光冰浴10 min后，在60 min內完成流式細胞儀分析。
4. 流式細胞儀分析
采用藍綠激發(fā)光的488nm的氬離子激光器。
? 設定1個gate在FL2的直方圖（紅色熒光），圈定含有人類二倍體細胞相同DNA的細胞群（用于排除細菌，見英文原版圖Fig. A）
每個樣本收集10,000-15,000 白細胞。
? 數據評估
對發(fā)生吞噬作用細胞（粒細胞和單核細胞）的百分比和其平均熒光強度（細胞吞噬細菌數量）進行分析。在散點圖 lin FSC/lin SSC中圈定所要檢測細胞群（粒細胞，單核細胞），見英文原版圖Fig.2A，2C；并對其綠色熒光強度的FL1的直方圖進行分析，見英文原版圖Fig.2B，2D。
陰性對照管（在FL1坐標軸上設定maker，使1~3%的細胞在陽性區(qū)域。
測試管中發(fā)生吞噬作用的細胞顯示在marker內，為的陽性細胞，平均熒光強度與每個白細胞吞噬的細菌數量相關。
5. 注意事項（Remarks）
? 肝素化抗凝的全血需要在采集后24 h進行處理，在處理前在室溫條件下保存。
? 嗜酸性粒細胞（過敏及寄生蟲感染時數量增多）顯示自體熒光增長，在0°C 時的陰性對照分析會被顯示出來。
? 吞噬細胞在37°C的大小和顆粒度會與陰性對照的樣本不同，這一點在圈定細胞區(qū)域的時候要注意。另外，細胞可能會由于在37°C條件下的自體溶解或者粘附在塑料表面而丟失減少。
? 在建立試驗方法時，采用重復管是非常有用的。
? 提供的試驗方法是在*條件下（如，調理的大腸桿菌等）考察樣本的吞噬功能。在正常人體給藥后進行體內或者體外吞噬功能檢測時通常只有一定程度增加。
進行體外試驗檢測藥物作用時，可進行時間依賴性動力學試驗（與大腸桿菌孵育2.5或者5 min）或者稀釋菌液（1：4或者1:8）
? 大腸桿菌已經受調理素的作用過的，但是全血中的血清還會對其有一定的影響。所以當采用除全血樣本以外的樣本，如HL-60 （人早幼粒白血病細胞），分離的單核細胞，巨噬細胞與大腸桿菌孵育時，孵育體系可加入5-20% 胎牛血清或者人血清。同時也可能有必要延長孵育時間（60 min-240 min）。
? 未受調理素作用的FITC標記的大腸桿菌（REAG F，試劑盒未包括），可用于檢測病人血清使細菌受調理素作用的能力。
6. 其他限制（Limitations）
? 每個實驗室需要根據自己實驗條件建立的自己的參考值范圍。
? 樣本需要至少有95%的活細胞且需要*被抗凝。含有衰老的細胞和未*抗凝的血樣可能導致非特異染色，可能是由于血小板的凝集和死細胞的泄漏的DNA引起的。
? 大腸桿菌（大約4 x 107/20μL）與白細胞（在100 μL全血）的比例為50:1（假設白細胞為8000個/μL），比例為80:1（假設白細胞為5000個/μL）。當樣本的白細胞數量與正常范圍不同時（4000-10000）需要根據其數量加入相應數量的大腸桿菌。
? 樣本在未加入DNA染液（REAG E）上流式細胞儀檢測前，在冰上放置24 h是穩(wěn)定的，但是熒光強度會系統(tǒng)性的丟失。
7. 關于進行定量分析的重要的說明（important instruction for quantitative analysis）
? 吞噬過程是主要依賴于溫度，所以在整個樣本處理過程中樣本的溫度，孵育條件的溫度是需要嚴格遵守。溫度計應采用可以顯示小數點后一位的型號。
? 實驗的可重復性和標準化操作是非常重要的，所以需要嚴格按照試劑說明書和自己改動步驟（如果有改動）進行操作。
? 任何流式細胞儀的改動都要考慮，因為這會影響到“Geomean”的值，所以使用校準微球（beads）對流式細胞儀進行每日的校準是非常有必要的。